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森貝伽生物：開(kāi)學(xué)啦，這些細(xì)胞常見(jiàn)問(wèn)題你遇到了嗎？

一、細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)出現(xiàn)狀態(tài)異常的原因及解決方式？

① 污染：

培養(yǎng)器皿可能受到細(xì)菌、真菌或其他微生物的污染，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不佳。所以我們需要確保在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，耗材及操作等都必須嚴(yán)格按照無(wú)菌要求，避免任何可能的污染源。

② 營(yíng)養(yǎng)不足：

培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足或不平衡，無(wú)法滿足細(xì)胞的需求。這時(shí)候需要根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型的需求，調(diào)整培養(yǎng)基成分，確保提供適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

③ pH值異常：

培養(yǎng)基的 pH 值偏高或偏低，超過(guò)了細(xì)胞所能耐受的范圍。一般動(dòng)物細(xì)胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，其pH維持在7.4時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)最好。

④ 氧氣和二氧化碳濃度：

培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣和二氧化碳濃度不合適，會(huì)直接影響細(xì)胞的呼吸和代謝。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需要提供一定量的氣體（氧氣和二氧化碳）。CO2具有調(diào)節(jié)pH和緩沖的作用，一般提供5% CO2。

⑤ 細(xì)胞密度過(guò)高：

細(xì)胞在培養(yǎng)皿中過(guò)于密集，導(dǎo)致缺乏足夠的營(yíng)養(yǎng)和空間。在培養(yǎng)過(guò)程中需要根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和培養(yǎng)皿的大小，調(diào)整細(xì)胞的種植密度，確保細(xì)胞能夠獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)空間。

⑥ 細(xì)胞凍存方式不當(dāng)：

細(xì)胞在凍存時(shí)不恰當(dāng)導(dǎo)致細(xì)胞在-80℃冰箱或者是在液氮當(dāng)中死亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法復(fù)蘇。在凍存細(xì)胞前要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，合理使用程序降溫盒進(jìn)行梯度降溫。


二、細(xì)胞培養(yǎng)中不貼壁了怎么辦？

① 消化過(guò)度：

在消化過(guò)程中縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度，鏡下觀察細(xì)胞剝離的狀態(tài)，及時(shí)終止消化。

② 支原體污染：  

取培養(yǎng)24小時(shí)的培養(yǎng)基，檢測(cè)支原體。清潔培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

③ 培養(yǎng)基pH值過(guò)堿（NaHCO3分解）：

可以使用無(wú)菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無(wú)菌CO2來(lái)調(diào)整培養(yǎng)液的PH值。

④ 細(xì)胞老化：

建議復(fù)蘇新的保種細(xì)胞，一般細(xì)胞老化的細(xì)胞會(huì)持續(xù)出現(xiàn)較嚴(yán)重的形態(tài)變化或者凋亡的情況。

⑥ 接種細(xì)胞起始濃度太低或太高 。

建議調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度。當(dāng)細(xì)胞濃度太高則貼壁位置不夠，細(xì)胞濃度太低則勢(shì)單力薄，培養(yǎng)基的輕微晃動(dòng)就可能使其脫落。


三、關(guān)于培養(yǎng)基的常見(jiàn)問(wèn)題

① 為什么培養(yǎng)基顏色會(huì)有不同深淺：

不同品類(lèi)的培養(yǎng)基中的酚紅指示劑添加含量也是不相同的，所以客戶會(huì)看到不同種類(lèi)的培養(yǎng)基會(huì)有不同顏色；一般顏色的深淺為DMEM＞MEM＞DMEM/F12＞RPMI1640＞F12。

② 培養(yǎng)基在冰箱中為什么顏色會(huì)變深：

因?yàn)樵诳諝庵蠧O2濃度低，而培養(yǎng)基內(nèi)CO2則會(huì)逐漸溢出，HCO3-減少，就會(huì)造成培養(yǎng)基偏堿，液體顏色變深。

③ 培養(yǎng)基中含有谷氨酰胺的保存條件：

谷氨酰胺對(duì)溫度比較敏感，溫度越高的話降解速度越快。并且谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，一般應(yīng)置于-20℃冰箱中保存。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基應(yīng)存放在2℃–8℃溫度中保存。

④ DPBS和PBS有什么區(qū)別：

這兩者都屬于磷酸鹽緩沖液，成分上只有一點(diǎn)點(diǎn)磷酸鹽的含量差異，均有等滲和調(diào)節(jié)pH的功能，大多數(shù)對(duì)于細(xì)胞的使用上可以通用。

⑤ HBSS和PBS/DPBS有什么區(qū)別：

HBSS緩沖液中鹽成分較PBS和DPBS更復(fù)雜，且含有葡萄糖，可為細(xì)胞提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)，而PBS/DPBS不能提供營(yíng)養(yǎng)。